如何保證羅氏定量PCR儀的溫度控制的準確性？

溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性，它直接關系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對于PCR反應而言zui重要的莫過于溫度控制的準確性，由于PCR是一個幾何級數擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗，所謂差之毫厘，謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質量。

溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關系到在不同樣品孔進行反應結果的一致性。我們在實驗中發現有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應程序，zui后的結果竟然差異非常明顯，或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。

溫度控制除了度，還有一個廠家喜歡大力宣傳的指標——升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間，能提高PCR反應煌特異性。因此從本質而言溫控方式就從以前相對穩定耐用的機械式轉向了升降溫更快速的半導體。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。

現在的羅氏定量PCR儀一般具有兩種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應管溫控模式）（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據探se器直接探se的溫控模塊（即承載樣品的金屬臺）的溫度進行控制，這種模式適用于長時間的靜態孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應管溫控模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內/PCR板孔內樣品液的溫度來進行控制。一般說來，試管溫控更為準確，因為管內樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用只有模塊溫控模式的話，反應混合物孵育的時間與程序設定的時間會有相當大的差距。而反應管控制的算法能自動補償時間，而且適合各種類型的反應管，確保反應混俁物按照程序設定的時間維持預設溫度。

有的羅氏定量PCR儀廠家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個熱敏電極插入一個專門的測量管中（管中裝有礦物油），反應進行時，將該測量管插入溫控模塊的樣品進行檢測。他們認為通過此途徑可以監測反應管內樣品的實際溫度，但這種方法未免有些華而不實；（1）測量管中礦物油的溫度變化與實際反應樣品的溫度變化未必一致；（2）因為測量管必須占用一個樣品孔，所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實驗。