流式細胞儀的調試和使用

　　簡介
 

　　古語說：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應用流式細胞分析和分選技術，必需先對儀器進行調試，使其處于良好的工作狀態，并能正確使用儀器。下面簡要介紹細胞計的調試項目及要點、使用的程序等等。
 

　　調試和校準
 

　　流式細胞儀在使用前，甚至在使用過程中都要精心進行調試，以保證工作的可靠性。調試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區的光路等。
 

　　激光強度：除調整反射鏡的角度以調整到所需波長的激光出光外，還要結合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為大。
 

　　液流速度：可通過操作臺數字顯示監督，調節　氣體壓力大小以獲得穩定的液流速度。
 

　　測量區光路調節　：這是調試工作的關鍵。需要保證在測量區的液流、激光束、90散射測量光電系統垂直正交，而且交點較小。一般可在用標準熒光微球等校準中完成。
 

　　流式細胞術中所測得的量是相對值，因此需要在使用前或使用中對系統進行校準或標定，這樣才能通過相對測量獲得的意義。因而FCM中的校準具有雙重功能：儀器的準直調整和定量標度。標準樣品應該穩定，有形成份形狀應是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經濟、容易獲得。常用標準熒光微球作為非生物學標準樣品，雞血紅細胞做為生物學標準樣品。微球用樹脂材料制作，或標有熒光素，或不標記熒光素。所用的雞血紅細胞標準樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血(抗凝劑：雞血=1：4)，經PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細胞混合，室溫下振蕩醛化24h，后經PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經熒光染色，所測光信號為雞血紅蛋白的自發熒光。
 

　　儀器的操作和使用
 

　　①打開電源，對系統進行預熱；
 

　　②打開氣體閾，調節　壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統；
 

　　③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統；
 

　　④利用校準標準樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0和90散射的熒光強度，并要求變異系數為小；
 

　　⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；
 

　　⑥樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統；
 

　　⑦因為實驗數據已存入計算機硬盤(有的機器還備有光盤系統，存貯量更大)，因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理；
 

　　⑧將所需結果打印出來。
 

　　操作和使用中的注意事項
 

　　1)光電倍增管要求穩定的工作條件，暴露的較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；
 

　　2)光源不得在短時間內(一般要1h左右)關上又打開；使用光源必須預熱并注意冷卻系統工作是否正常；
 

　　3)液流系統必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經過過濾、消毒；
 

　　4)注意根據測量對象的變換選用合適的濾片系統、放大器的類型等；
 

　　5)特別強調每次測量都需要對照組。