流式細胞儀技術概述

       流式細胞儀技術，主要是測量群體中單個細胞經適當染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點，當每個細胞經過焦點時，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經過過濾及光鏡系統收集到達一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態(tài)裝置)，光檢測器把散射光定量轉化成電信號，經數字轉換器進行數字化后而成整數，然后進行電子存儲，以后數據可以調出顯示和進行分析。其優(yōu)點如下：
1、具有操作簡便，只要將染色的單個細胞推入儀器中，就會得出數據。
2、具有較高的靈敏度及測定速度，而且每次可測出許多數據，一般情況下，每秒可測5000個細胞，能迅速分析和記數大量細胞，并能準確統計群體中熒光標記細胞的比例。
3、應用廣泛，即可用于測定細胞活力、繁殖周期和細胞定型分析，也可區(qū)別死亡細胞、分裂細胞和靜止細胞群，既可測定DNA和RNA、測凋亡峰，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白。
一、樣品的制備
流式細胞儀是測定一個或重復的每個顆粒經光路的信號，因此，細胞必須做成單個細胞懸浮狀態(tài)，不能聚集，也不允許有細胞碎片存在。所用染料必須特異(如特異單抗)，而且不允許滲透至載液中。
標本如果是屬于淋巴細胞等血細胞、骨髓細胞或白血病細胞系或類淋巴細胞系，要經Ficoll分離，作單細胞分離處理，但若為實體組織或貼壁生長的上皮成纖維樣細胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)，化學法(EDTA、EGTA和檸檬酸鹽)消化分散液或洗液用無鈣、鎂PBS，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時采用機械分散法，將經消化處理的膨松組織，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸，過一下尼龍或不銹鋼網篩100μm和20μm。細胞濃度要保證在1～2×106/ml。
若標本用于測定單個細胞，需加入1～5mg/L的DNAase，將有助于阻止破碎細胞釋放的DNA造成細胞再聚集，但是若分離的細胞要作DNA含量測定之用時，則切勿加DNAase。
二、懸浮細胞的固定
上述制備的活細胞即可用于流式細胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進行，或為了提高染色效果，則要將細胞預固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法：
(1)甲醛法：在細胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12～18小時。
(2)乙醇法：細胞懸于PBS中，緩慢加入-20℃預冷的95%乙醇，使終濃度為70%，冰浴30分鐘。
(3)丙酮法：于細胞懸液中，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%。
2、實例：
(1)用預冷的無鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細胞制成1×106細胞的懸液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達70%。
(3)該細胞可在4℃下保存數日。
(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇，再將細胞懸于PBS中或要求的試劑中。
三、流式細胞儀分析的應用
(一)非染色細胞的光散射
一個粒子(如細胞)出現在一束光線中，立即會干擾該光束，造成該光束入射光的重分布，該細胞所獲能量則以衍散、折射、反射等復雜的參數形式重新發(fā)射出來，這些參數與細胞體積、表面構象、內部結構形成函數關系，可測低角前面約10°的光散射及90°的光散射。
一般認為，90°位置的光散射值主要受細胞內部結構所致的光反射和折射影響，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細胞大小。光散射測量方法如下：
(1)將細胞懸浮于HBSS中，濃度介于1×106～2×106/ml濃度之間。
(2)以懸浮細胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細胞貯藏池。
(3)設定細胞流量為500個/S(秒)，以獲得*測定結果。
(二)染色法
1、細胞的碘化丙錠(propiolium iodide，PI)染色
PI和EB(溴化乙錠)為同類物質，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強度增加約20倍，PI的熒光強度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長激發(fā)，DNA/PI復合物zui大的發(fā)射波長約為615nm。
1.1 小鼠Lewis肺癌細胞(3LL)DNA含量測定方法
(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內用PBS沖洗;
(2)去除結締組織及脂肪，剪碎腫塊;
(3)小碎片移入1.20×38mm注射針，加壓使其通過，于4℃條件下重懸細胞于HBSS中。
(4)將200～300μL細胞懸液(5×105細胞/ml)中加入3ml PI(50μg/ml)，染色3LL細胞，于4℃存放20～30分鐘。
(5)測定580～750nm之間的發(fā)射熒光，以去除末結合PI產生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。
注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000ml+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2 培養(yǎng)細胞DNA的流式細胞儀分析
(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次;
(2)加入PI5ml于培養(yǎng)皿中，在4℃放10分鐘;
(3)用吸管反復次打細胞，使細胞破壞，胞核釋放出來，再行流式細胞儀分析。
1.3 完整細胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的細胞懸液，離心，去固定液;
(2)室溫條件下加入PI染色一批細胞(105～106細胞/ml)，時間為30分鐘，然后行流式細胞儀分析。
1.4 光輝霉素和PI的DNA染色
在熒光抗生素光輝霉素和PI聯合染色過程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產生能量轉移，該染色技術主要用于實體腫瘤組織，精子細胞及婦科標本，同時也適用于體外培養(yǎng)的細胞。
(1)分離制備的細胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光輝霉素染色，4℃1小時(PI為10mg/L、光輝霉素為10mg/L)。
(3)染色后進樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細胞核酸，或作溶酶體的一種標記。觀察死亡細胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細胞和靜止細胞群體。雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復性結果，但該方法已被許多實驗室廣泛采用。方法如下：
(1)試劑：
溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。
Triton X-100(0.1%0.1ml，1mol/LHCL 8ml
1mol/LNaCI15ml蒸餾水76ml，PH1.5(100ml)
溶液B：穩(wěn)定期數月，除菌以后(高壓或過濾)貯存。
0.01mol/LEDTA10ml，1mol/LNaCI15ml
0.4mol/LNa2HPO4 31.5ml，0.2mol/L檸檬酸18.5ml
蒸餾水24ml，總體積為99ml，pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應小心)，吖啶橙應用液0.1ml母液加9.9ml溶液B稀釋。
注意：儀器鞘流系統應保持4℃。
氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm)，綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制細胞懸液，取0.2ml(8×106細胞/ml)，加入0.4ml溶液A，4℃放置45～60秒。
②加1.2ml含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。
③應在加入溶液B后10分鐘內進流式細胞儀分析。
注意：①細胞數保持恒定;②核酸與吖啶橙的比例;③染色時間及溫度。
(三)染色法的應用
1、變性及雙鏈DNA的鑒別染色
(1)試劑：
HBSS內含1000u/ml RNA酶A，0.2mol/LKCl，pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5mg/L(16.7μm)，0.2mol/L Na2HPO4 緩沖液，pH2.6。
①2×106細胞懸于1mlHBSS/RNase液中。
②37℃溫育1小時。
③將0.2ml細胞懸液(含4×105細胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5ml0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20℃ 30分鐘。
④加2ml吖啶橙染色2分鐘。
⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細胞中單鏈及雙鏈DNA含量。
2、DNA與癌基因探針雙標記測定
這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標記癌基因表達產物，然后用PI標記DNA，現以研究白血病細胞增殖與癌基因的關系說明操作步驟：
(1)制備白血病細胞懸液，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘。
(2)取50μl50mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結合)，4℃作用30～45分鐘。
(3)用PB離心洗滌2次，重懸浮于50μlHBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。
(4)加入50μl1：200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分鐘。
(5)同(3)洗滌后加入50μl1：40的FITC標記的羊抗兔IgG，4℃反應30～45分鐘。
(6)同(3)洗滌后，細胞用RNA酶消化，室溫20～30分鐘。
(7)同(3)洗滌后，用PI染液染20分鐘。
(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長測定。FITC染色顯示ras癌基因表達產物，PI染色顯示DNA含量。
注意事項：
①制備樣品時，離心次數不宜過多，防止細胞丟失和凝集;
②細胞固定時間不宜過長，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑;
③為了降低本底，應將細胞表面未結合的熒光染料洗凈;
④進行雙標記沉淀時，應盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。
3、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進行細胞周期分析
(1)試劑：
用培養(yǎng)基配制33mg/LBrdu及脫氧細胞苷26.4g/ml。
染色液：Hoechst33258溶于PBS，細胞染色24小時后進行分析，據報道染色的穩(wěn)定時間在30分鐘至24小時之間。
(2)方法：
①將Brdu溶液按1：10加入細胞培養(yǎng)液中。
②根據細胞周期時間不同，選擇不同時間培養(yǎng)的細胞。
③孵育后，搖散細胞以傳代培養(yǎng)。
④直接用染液重懸細胞，進入流式細胞儀分析。
Hoechst33258熒光值在410～580nm之間，需用330～360nm紫外光激發(fā)。應特異性結合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對。因此，不僅特異性標記DNA，亦可標記胸腺嘧啶。在細胞周期分析時，在與細胞孵育過程加入Brdu，Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內的細胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產生一新峰，此項技術可用于直接測定細胞G2期及分裂時間。
4、Hoechst33342染色活細胞DNA
(1)試劑：Hoechst 33342，用蒸餾水配成0.25mol/L。
(2)方法：
①制備106/ml細胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為5～10mg/L ，室溫下20分鐘。
②分析前切勿洗滌細胞。
Hoechst33342可用作細胞DNA的活體染料，據信可在保持細胞活性的同時，呈現出相當好的DNA化學計量關系，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間，發(fā)射波則在450nm處。
5、以異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC)染色蛋白質。
(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40mg/LRNase的PBS配成0.1～1.0mg/L濃度。
(2)方法：
①染色前用終濃度70%乙醇固定細胞，至少18小時。
②離心固定細胞，棄去固定液。
③室溫下用FIFC染色細胞蛋白，30分鐘。
④流式細胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長488nm，熒光發(fā)射波長515～535nm。
也可于固定細胞中，以18mg/L(0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質雙重染色，分別呈現紅色熒光(DNA)和綠色熒光(蛋白質)。
6、熒光素抗體的應用
該技術既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細胞，可用熒光素或若丹明標記單克隆抗體處理上述細胞;也可用于測定胞漿中的蛋白質(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸鹽緩沖液Eagle’s MEM稀釋FIFC連接的抗體內含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FIFC抗體的zui適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細胞中加入50μl不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認*染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時，應稀釋成5mg/L或0.25mg/L。無論鼠或人細胞在2×107濃度時其存活率應在90%以上。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μl抗體稀釋度，再加入50μl細胞懸液，混勻。
(2)冰浴45分鐘，離心滴定板(1500r/min10分鐘)。
(3)棄上清，以培養(yǎng)基100μl洗滌細胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min10分鐘，棄上清。
(4)以1ml預冷的培養(yǎng)基配成1×106細胞/ml的已染色細胞懸液，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)。
目前流式細胞儀(FCM)已在各學科中獲得應用。
①細胞生物學：定量分析細胞周期并分選不同細胞周期時相的細胞;分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達產物等物質與細胞增殖周期的關系，進行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體。
②腫瘤學：DNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標。近年來已應用DNA倍體測定技術，對白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測。用單克降抗體技術清除血液中的腫瘤細胞。
③免疫學：研究細胞周期或DNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關系;進行免疫活性細胞的分型與純化;分析淋巴細胞亞群與疾病的關系;免疫缺陷病如艾滋病的診斷;器官移植后的免疫學監(jiān)測等。
④血液學：血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等;用NBT及DNA雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細胞增殖周期變化的關系，檢測母體血液中Rh(+)或抗D抗原陽性細胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴重溶血;檢測血液中循環(huán)免疫復合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。
⑤藥物學：檢測藥物在細胞中的分布，研究藥的作用機制，亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤的凋亡機制，可通過測DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調節(jié)蛋白等。