試析BD流式細胞儀的參數測量的科學原理

散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由于光學性質的改變，其散射光信號當然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。

在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角(即0角)散射(FSC);②側向散射(SSC)，又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大;對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系;對于形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。

在實際使用中，BD流式細胞儀首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量zui有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色，細胞內部的熒光分子經光照射后所發出的熒光;②特征熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為噪聲信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對于結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子(例核黃素、細胞色素等)的含量越高，自發熒光越強;培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強;細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。

BD流式細胞儀減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料;②選用適宜的激光和濾片光學系統;③采用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。